fa همسانه‎سازی، بیان، تخلیص و ارزیابی سمیّت پروتئین هیبریدی توکسین دیفتری- اینترلوکین 2 فناوری‌های مرتبط با طب انتظامی Police Medicine Related Technologies پژوهشی اصيل Original Research <p>مقدمه: ایمونوتوکسین یک پروتئین هیبریدی و دارای دو بخش کاملاً مجزا است که توسط رابط‌های مشخص و به‌صورت کووالان به یکدیگر متصل هستند: یک بخش ایمنی که نقش تشخیصی و اتصال ایمونوتوکسین به گیرنده‌های خاص را بر عهده دارد و یک بخش توکسینی یا سمی که نقش سیتوتوکسیک و مرگ سلولی را بر عهده دارد. هدف از مطالعه حاضر، تولید یک پروتئین هیبریدی با استفاده از اتصال مولکولی توکسین دیفتری (DT) به اینترلوکین 2 انسانی (IL2)، به‌منظور استفاده از آن در بیماران مبتلا به لنفوما می‌باشد. مواد و روش‌ها: پس از سنتز اولیه توالی ژنی رمز کننده پروتئین هیبریدی مذکور (IDZ: DT-IL2)، همسانه&lrm;سازی قطعه مربوطه در سیستم بیانی pET، صورت گرفت. پلاسمید pET-IDZ تولیدی، درون باکتری BL21(DE3) منتقل و سپس القاء گردید. در ادامه تخلیص پروتئین با استفاده از سیستم کروماتوگرافی تمایلی نیکل (Ni-NTA) انجام شد و در نهایت عملکرد پروتئین هیبریدی نوترکیب تولیدی بر روی رده سرطانی K-562 که دارای گیرنده سطحی برای اینترلوکین 2 است، با استفاده از روش سنجش زیستی MTT، مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفت. یافته‌ها: پس از تولید پلاسمید pET-IDZ، بیان پروتئین هیبریدی نوترکیب در باکتری BL21(DE3)، با استفاده از روش‌های الکتروفورز و وسترن بلات، تأیید گردید. تخلیص پروتئین هیبریدی، خلوص بالای 95 دزصد را با استفاده از روش دانسیتومتری، نشان داد. در ادامه سلول‌هایK-562 با غلظت‌های مختلف پروتئین هیبریدی تولیدی، تیمار شد. نتایج حاصله نشان داد که میزانIC50% (غلظتی از پروتئین هیبریدی برای از بین بردن 50 درصد سلول‌ها)، 10-10 &times; 6 مولار است. نتیجه‌گیری: ایمونوتوکسین یا توکسین هدف‌گذاری شده به‌عنوان یکی از استراتژی‌های نوین درمانی بیماران سرطانی به‌حساب می‌آیند. اولین نمونه نوترکیب این پروتئین‌های هیبریدی (با نام اونتاک) در سال 1999 از سازمان غذا و داروی آمریکا تأییدیه دریافت کرد که در آن توکسین دیفتری به اینترلوکین 2، متصل شده بود. با توجه به اهمیت داروی مذکور، تلاش گردید این دارو در داخل کشور تولید شود. نتایج حاصل از عملکرد اولیه نمونه تولیدی، بیانگر صحت نمونه است. ولی لازم است آزمایشات تکمیلی و مقایسه آن با نمونه خارجی صورت پذیرد.</p> <p>Background: Immunotoxin is a fusion protein containing two distinct sections covalently bonded by specific linkers. It includes an immunological section with a diagnostic role to connect the immunotoxin to the specific receptors and a toxic section with a cytotoxic role that leads to the cell death. The aim of this study is development of a lymphoma cancer protein therapy method using a recombinant immunotoxin produced by connecting diphtheria toxin to human interleukin 2 (IL2). Materials and Methods: After the synthesis of the fusion protein gene sequence (IDZ: DT-IL2), subcloning was done in the pET expression system. The pET-IDZ plasmid was transformed to BL21 (DE3) bacteria and then was induced. The protein purification was accomplished by nickel affinity chromatography system and then the function of the produced recombinant fusion protein was evaluated on K-562 cancerous cell line by MTT biological assay. Results: After production of pET-IDZ plasmid, the expression of the recombinant fusion protein in BL21 (DE3) bacteria was validated using electrophoresis and Western Blot methods. The purification yield determined above 95% using densitometry method. Afterwards, K-562 cells were treated by different concentrations of the produced fusion protein. The results showed the proper function of the produced fusion protein. Also, IC50 % amount (immunotoxin concentration to remove 50% of the cells) was determined as 6&times;10-6 M. Conclusion: Immunotoxin or targeted toxin is a novel strategy for cancer patients. The first recombinant immunotoxin (named Ontak), in which diphtheria toxin had been connected to interleukin 2, was approved from United States Food and Drug Administration (FDA) in 1999. Considering the importance of this drug, recombinant fusion protein was attempted to be produced in this research. Experimental data confirmed effective protein function, but complementary studies will be required to be compared with Ontak.</p> کلون, بیان, تخلیص, ایمونوتوکسین, دیفتری, اینترلوکین. cloning, expression, purification immunotoxin, diphtheria, interleukin 125 132 http://jpmed.ir/browse.php?a_code=A-10-152-3&slc_lang=fa&sid=1 معصوم امرایی 10031947532846004796 10031947532846004796 No 1M.Sc., Biochemistry, Department of Bioscience and Biotechnology, Mallek Ashtar University of Technology, Tehran, Iran. کارشناس ارشد، بیوشیمی، پژوهشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران. مهدی زین الدینی zeinoddini@yahoo.com 10031947532846004797 10031947532846004797 Yes 2Assistant Professor, Department of Bioscience and Biotechnology, Mallek Ashtar University of Technology, Tehran, Iran. دکترای، بیوشیمی، استادیار، پژوهشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران. مسعود سلیمانی 10031947532846004798 10031947532846004798 No 3Associate Professor Department of Medicine, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran. دانشیار، دانشکده پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران. علی رضا سعیدی نیا 10031947532846004799 10031947532846004799 No 4Assistant professor, Department of Bioscience and Biotechnology, Mallek Ashtar University of Technology, Tehran, Iran. استادیار ژنتیک، پژوهشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران.