fa تولید آنزیم لوسیفراز ایرانی جهش‌یافته به روش SDM با کاربرد تشخیص بالینی فناوری‌های مرتبط با طب انتظامی Police Medicine Related Technologies پژوهشی اصيل Original Research <p>مقدمه: آنزیمی که واکنش بیولومینسانس یا نشر نور را در تعدادی از موجودات کاتالیز می‌کند لوسیفراز نام دارد. از واکنش کاتالیز شده توسط این آنزیم می‌توان در بسیاری از سنجش‌های تشخیص طبی ازجمله سنجش مقدار ATP در محیط، کیت‌های تشخیصی بر پایه لوسیفراز، تعیین مقدار آلودگی میکروبی در یک محیط، ساخت بیوسنسورها و گزارشگرهای زیستی استفاده نمود. در جهت پایدارسازی آنزیم با کمک روش جهش‌زایی هدف‌دار، لوسیفراز های نوترکیب مختلفی ساخته‌شده‌اند. یکی از این آنزیم‌ها با جهش L300R بر جهش‌یافته ERR (E354RR356) لوسیفراز ایرانی L.turkestanicus به&lrm;دست آمد که جهش‌یافته LRR (ERR/L300R) نام‌گذاری شد. این آنزیم اگرچه نسبت به آنزیم طبیعی به حرارت مقاوم‌تر بود، اما تقریباً غیرفعال بود. هدف از انجام این تحقیق ارزیابی امکان فعال‌سازی مجدد آنزیم غیرفعال شده LRR با کمک روش جهش‌زایی هدف‌دار جهت استفاده از آنزیم‌های جهش‌یافته در ساخت کیت‌های سنجش ATP و دیگر آزمایش‌های زیستی بوده است. مواد و روش‌ها: در این تحقیق با روش جهش‌زایی هدف‌دار اسیدآمینه گلوتامات 270 در آنزیم LRR به آلانین تبدیل شد. سپس مطالعات سینتیکی آنزیم انجام شد و خصوصیات ساختاری جهش‌یافته فوق نیز به‌وسیله تکنیک‌های فلورسنت و CD بررسی گردید. یافته‌ها: نتایج بررسی‌های سینتیکی نشان داد که آنزیم جهش‌یافته 270 فعال‌تر از LRR می‌باشد. همچنین مطالعات ساختاری نشان داد که آنزیم فوق هم از لحاظ ساختارهای دوم و هم ساختار سوم پروتئین، تغییرات عمده‌ای نموده است. نتیجه‌گیری: با جهشی که در جهش‌یافته 270 اعمال و سبب فعال‌تر شدن نسبی آن در مقایسه با LRR شد، پیشنهاد می‌شود بتوان از آنزیم 270 در ساخت کیت‌های سنجش بالینی استفاده نمود.</p> <p>Background: In the bioluminescence phenomenon which has been observed in many organisms, a luciferase catalyzes the oxidation of luciferin to oxyluciferin and a visible light is produced. Light production of luciferase is one of the most sensitive tools in the detection of ATP for measuring microbial contamination, study of protein-protein interactions in cells and construction of biosensors and genetic bioreporters. In spite of these applications, the weakness of firefly luciferase is its rapid inactivation. Many studies have been done to develop thermostable luciferases by site directed mutagenesis. One of these modifications was LRR mutant in which the Leu300 was substituted with Arg in the E354RR356 Lampyris turkestanicus luciferase as template. LRR was more thermostable than the wild-type but with only 0.02% activity. Materials and Methods: In this research by using the method of site-directed mutagenesis, glutamate 270 was substituted with alanine in LRR mutant as template. The kinetics parameters of the mutated enzyme were determined and its structural characteristics were also investigated with fluorescence and CD spectroscopy. Results: The kinetics results revealed that the mutant 270 was more active than LRR. Furthermore the structural studies showed the significant changes in secondary and tertiary structures in the mutated enzyme in comparison with LRR and wild-type samples. Conclusion: The 270 mutant was more active than the LRR and it is recommended that this mutant be used in medical assays kits production.</p> لوسیفراز, جهش‌زایی نقطه‌ای (SDM), فعالیت آنزیمی, ساختار سه‌بعدی luciferase, site-directed mutagenesis, enzyme activity, three dimensional conformation 9 16 http://jpmed.ir/browse.php?a_code=A-10-416-1&slc_lang=fa&sid=1 Zahra Sobhani-Damavandifar زهرا سبحانی دماوندی فر sobhanizahra10@gmail.com 10031947532846004811 10031947532846004811 No 1PhD Student, Biochemistry, Biochemistry Department, Biological Sciences Faculty, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran. دانشجوی دکتری، بیوشیمی، گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران. Saman Hosseinkhani سامان حسین خانی saman_h@modares.ac.ir 10031947532846004812 10031947532846004812 Yes 2Professor, Biochemistry Department, Biological Sciences Faculty, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran. استاد، گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران. Reza HassanSajedi رضا حسن ساجدی sajedi_r@modares.ac.ir 10031947532846004813 10031947532846004813 No 3Associate Professor, Biochemistry Department, Biological Sciences Faculty, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran. 3دانشیار گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران